Perbedaan Antara Sanger Sequencing dan Pyrosequencing

Perbedaan Kunci - Sanger Sequencing vs Pyrosequencing
 

Sekuensing DNA sangat penting untuk analisis DNA karena pengetahuan tentang pengaturan nukleotida yang benar pada wilayah DNA tertentu mengungkapkan banyak informasi penting tentang itu. Ada berbagai metode pengurutan DNA. Sanger sequencing dan Pyrosequencing adalah dua metode urutan DNA yang berbeda yang banyak digunakan dalam Biologi Molekuler. Perbedaan utama antara Sanger sequencing dan Pyrosequencing adalah itu Sanger sequencing menggunakan dideoxynucleotides untuk mengakhiri sintesis DNA untuk membaca urutan nukleotida sementara pyrosequencing mendeteksi pelepasan pirofosfat dengan menggabungkan nukleotida dan mensintesis urutan pelengkap untuk membaca urutan urutan yang tepat..

ISI
1. Ikhtisar dan Perbedaan Utama
2. Apa itu Sanger Sequencing
3. Apa itu Pyrosequencing
4. Perbandingan Berdampingan - Sanger Sequencing vs Pyrosequencing
5. Ringkasan

Apa itu Sanger Sequencing?

Sanger sequencing adalah metode sekuensing DNA generasi pertama yang dikembangkan oleh Frederick Sanger dan koleganya pada tahun 1977. Ini juga dikenal sebagai Sequencing Pengakhiran Rantai atau Sekuensing oksida karena didasarkan pada pemutusan rantai oleh dideoxynucleotides (ddNTPs). Metode ini banyak digunakan selama lebih dari 30 tahun hingga New Generation Sequencing (NGS) dikembangkan. Teknik sekuensing Sanger memungkinkan penemuan urutan nukleotida yang benar atau perlekatan fragmen DNA tertentu. Ini didasarkan pada penggabungan selektif ddNTPs dan penghentian sintesis DNA selama in vitro Replikasi DNA. Tidak adanya kelompok OH 3 'untuk melanjutkan pembentukan ikatan fosfodiester antara nukleotida yang berdekatan adalah fitur unik dari ddNTPs. Oleh karena itu, setelah ddNTP terpasang, perpanjangan rantai berhenti dan berakhir dari titik itu. Ada empat ddNTP - ddATP, ddCTP, ddGTP dan ddTTP - digunakan dalam sekuensing Sanger. Nukleotida ini menghentikan proses replikasi DNA ketika mereka dimasukkan ke dalam untai DNA yang tumbuh dan menghasilkan berbagai panjang DNA pendek. Elektroforesis gel kapiler digunakan untuk mengatur untaian DNA pendek ini dengan ukurannya pada gel seperti yang ditunjukkan pada Gambar 01.

Gambar 1: Elektroforesis gel kapiler dari DNA pendek yang disintesis

Untuk in vitro replikasi DNA, beberapa persyaratan harus disediakan. Mereka adalah enzim DNA polimerase, DNA templat, primer oligonukleotida, dan deoksinukleotida (dNTPs). Dalam sekuensing Sanger, replikasi DNA dilakukan dalam empat tabung reaksi terpisah bersama dengan empat jenis ddNTP secara terpisah. Deoxynucleotides tidak sepenuhnya digantikan oleh ddNTPs masing-masing. Campuran dNTP tertentu (misalnya; dATP + ddATP) dimasukkan dalam tabung dan direplikasi. Empat produk tabung terpisah dijalankan pada gel di empat sumur terpisah. Kemudian dengan membaca gel, urutannya dapat dibangun seperti yang ditunjukkan pada Gambar 02.

Gambar 02: Sanger sequencing

Sanger sequencing adalah teknik penting yang membantu dalam banyak bidang biologi molekuler. Proyek genom manusia berhasil diselesaikan dengan bantuan metode berbasis sekuensing Sanger. Sanger sequencing juga berguna dalam sekuensing DNA target, penelitian kanker dan penyakit genetik, analisis ekspresi gen, identifikasi manusia, deteksi patogen, sekuensing mikroba, dll..

Ada beberapa kelemahan dari sekuensing Sanger:

• Panjang DNA yang diurutkan tidak boleh lebih dari 1000 pasangan basa
• Hanya satu untai yang dapat diurutkan pada satu waktu.
• Prosesnya memakan waktu dan mahal.

Oleh karena itu, teknik sequencing canggih baru dikembangkan dengan waktu untuk mengatasi masalah ini. Namun, sekuensing Sanger masih digunakan karena hasil yang sangat akurat hingga sekitar 850 fragmen panjang pasangan dasar.

Apa itu Pyrosequencing?

Pyrosequencing adalah teknik pengurutan DNA baru berdasarkan “sekuensing dengan sintesis”. Teknik ini bergantung pada deteksi pelepasan pirofosfat pada penggabungan nukleotida. Proses ini dilakukan oleh empat enzim yang berbeda: DNA polymerse, ATP sulfurylase, luciferase dan apyrase dan dua substrat adenosine 5 'phosphosulfate (APS) dan luciferin.

Proses dimulai dengan pengikatan primer dengan templat DNA beruntai tunggal dan DNA polimerase memulai penggabungan nukleotida sebagai pelengkap. Ketika nukleotida bergabung bersama (polimerisasi asam nukleat), ia melepaskan gugus dan kelompok pirofosfat (dua gugus fosfat yang terikat bersama). Setiap penambahan nukleotida melepaskan jumlah pirofosfat yang sama. Pirofosfat dikonversi menjadi ATP oleh ATP sulfurylase dengan adanya substrat APS. ATP yang dihasilkan mendorong konversi yang dimediasi oleh luciferase dari luciferin menjadi oxyluciferin, menghasilkan cahaya tampak dalam jumlah yang sebanding dengan jumlah ATP. Cahaya dideteksi oleh perangkat pendeteksi foton atau oleh photomultiplier dan membuat pyrogram. Apyrase mendegradasi ATP dan dNTPs yang tidak tergabung dalam campuran reaksi. Penambahan dNTP dilakukan sekali dalam satu waktu. Karena penambahan nukleotida diketahui sesuai dengan penggabungan dan deteksi cahaya, urutan template dapat ditentukan. Pyrogram digunakan untuk menghasilkan urutan nukleotida DNA sampel seperti yang ditunjukkan pada Gambar 03.

Pirosequencing sangat penting dalam analisis polimorfisme nukleotida tunggal dan sekuensing rentangan pendek DNA. Keakuratan tinggi, fleksibilitas, kemudahan otomatisasi, dan pemrosesan paralel adalah keunggulan pyrosequencinging dibandingkan teknik sekuensing Sanger.

Gambar 03: Pyrosequencing

Apa perbedaan antara Sanger Sequencing dan Pyrosequencing?

Sanger Sequencing vs Pyrosequencing
Sanger sequencing adalah metode pengurutan DNA berdasarkan penggabungan selektif ddNTP oleh DNA polimerase dan pemutusan rantai.	Pyrosequencing adalah metode sekuensing DNA yang didasarkan pada deteksi pelepasan pirofosfat setelah penggabungan nukleotida.
Penggunaan ddNTP
ddNTP digunakan untuk menghentikan replikasi DNA	ddNTP tidak digunakan.
Enzim terlibat
DNA polimerase digunakan.	Empat enzim yang digunakan: DNA polimerase, ATP sulfurylase, Luciferase dan Apyrase.
Substrat yang Digunakan
APS dan Luciferin tidak digunakan.	Adenosine 5 'phosphosulfate (APS) dan luciferin digunakan.
Suhu maksimum
Ini adalah proses yang lambat.	Ini adalah proses yang cepat.

Ringkasan - Sanger Sequencing vs Pyrosequencing

Sanger sequencing dan Pyrosequencing adalah dua metode urutan DNA yang digunakan dalam biologi molekuler. Sanger sequencing mengkonstruksi urutan nukleotida secara berurutan dengan menghentikan perpanjangan rantai sedangkan pyrosequencing menyusun urutan nukleotida secara berurutan dengan menggabungkan nukleotida dan mendeteksi pelepasan pirofosfat. Oleh karena itu, perbedaan utama antara sekuensing Sanger dan Pyrosequencing adalah bahwa sekuensing Sanger bekerja pada sekuensing dengan pemutusan rantai sedangkan pyrosequencing bekerja pada sekuensing dengan sintesis.

Referensi:
1. Fakruddin, Md, dan Abhijit Chowdhury. "Pyrosequencing- Sebuah Alternatif Pengurutan Sanger Tradisional." American Journal of Biokimia dan Bioteknologi. Publikasi Sains, 02 Maret 2012. Web. 28 Februari 2017.
2. "Sanger sequencing." Sanger sequencing - Topik ScienceDirect. N.p., n.d. Web. 28 Februari 2017

Gambar milik:
1. “Didesoxy-Methode” Oleh Christoph Goemans (modifiziert) - Dr. Norman Mauder, auf Basis einer Datei von Christoph Goemans (CC BY-SA 3.0) melalui Commons Wikimedia
2. "Sanger-DNA-seq" Oleh Enzo di Wikipedia bahasa Polandia (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia
3. "Pyrosequencinging" oleh microbiologybytes (CC BY-SA 2.0) via Flickr